肝臓ヒト化テッドベット 入金できないの歴史 第１０話
株式会社トランスジェニック 顧問 山村研一
新たなレシピエントテッドベット 入金できないの開発
前回の論文では、ヒト肝テッドベット 入金できないを移植後にhGHを投与すると、GHRおよびhIGF1-hIGFRのシグナル伝達が活性化され、ヒト肝テッドベット 入金できないの増殖亢進、置換率が上昇すること、血中hAlb値が増加すること、hGHは若いドナーの肝テッドベット 入金できないの方がより大きな効果が期待できることが示されました。今までのレシピエントマウスはuPAが肝臓で発現しマウス肝テッドベット 入金できないが死滅する系でした。このレシピエントマウスの欠点は、出血のため60-70%が死亡するという飼育効率の悪さ、移植可能な時期が生後5日から30日の間に限られること、uPA遺伝子の欠失によりマウス肝テッドベット 入金できないが復活すること、腎疾患の発症などがあり、これらを克服したいというのが目的となります。このため、今回は、肝臓で発現しているFah (Fumarylacetoacetate hydrolase)を欠損させ肝テッドベット 入金できないを死滅させる系で、かつ免疫寛容にするため今までとは違う系を用いた新しいレシピエントマウス「Fah-/-:Rag2-/-:Il2rg-/-(FRGと略)」(Azuma et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- mice. Nat. Biotechnol. 25:903-916, 2007)の論文を紹介したいと思います。
今回の着目点はちょっと多いのですが９つもあります。
第１は新しいレシピエントテッドベット 入金できないとして「FRG」を用いています。この中のFah欠損がマウス肝テッドベット 入金できないを死滅させる系ですが、まずこの論文では書かれていませんが、補足として「Fah-/-」マウスでの肝テッドベット 入金できない死のメカニズムについて説明します。第２は免疫寛容とするための「Rag2-/-:Il2rg-/-」の特徴について説明します。第３は、テッドベット 入金できないです。Tg(Alb-uPA)テッドベット 入金できないと違い、Fah-/-テッドベット 入金できないは何もしないと出生後12時間以内に死亡しますので、肝臓ヒト化マウスの作製には工夫が必要でその方法を紹介します。第４は、ヒト肝テッドベット 入金できないの生着率と置換率です。第５は、この新しい方法で作製した肝臓ヒト化マウスの肝臓はきちんと構築され機能は正常かどうかです。第６は、コラム第8話で述べられた腎臓の病変の有無です。第７は、連続移植というもので、一旦作製した肝臓ヒト化テッドベット 入金できない取り出してそれを用いて肝臓ヒト化マウスを作製できるのかどうかです。これは初めての試みです。これができると高価なヒト肝細胞をその都度購入しなくても良くなり非常に有効な方法となります。第８は、移植したヒト肝細胞とマウス肝細胞が融合しているかどうかの検証です。もしそうであればこの融合した細胞が見かけ上の「肝細胞再増殖」の理由となり肝臓ヒト化マウスではなくなってしまい、重要な検証項目です。第９は、これまでもTg(Alb-uPA)では解析されていますが薬物代謝のデータです。新たなレシピエントテッドベット 入金できないでは何が影響するかわかりませんので必要なデータということになります（特にNature Biotechnologyのようないいジャーナルでは要求されることが多いです）。第10は、FRGテッドベット 入金できないの利点です。それでは順番に結果を見ていきましょう。
１．「Fah-/-」テッドベット 入金できないの特徴
Fahはヒトの遺伝性チロシン血症I型の原因遺伝子で、これを欠損する患者は肝不全、腎障害、心筋障害が起こり1年以内に死亡することが知られています。テッドベット 入金できないでもこのFah遺伝子を破壊することにより同様の症状が出ることが確認されています(Grompe et al. Genes Dev. 7:2298, 1993)。Fahはチロシン代謝経路の最終の酵素であり、この欠損により前駆物質が蓄積します（図１）。前駆物質のうち、maleylacetoacetate、fumarylacetoacetateおよびその代謝産物であるsuccinyl acetoneが毒性を有するため、肝障害が起こります。また、ヒトのチロシン血症I型の治療薬としてNTBC(2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione)（商品名Nitisinone）が1991年に使用が開始され、Fah欠損テッドベット 入金できないでも有効であることが示されています(Grompe et al. Nat. Genet. 10:453-460, 1995)。つまりNTBCは、代謝経路の上流にあるHGAD(homogentisate oxidase)の阻害剤であり、これを阻害すると、上記の有毒物質の産生はなくなります。したがって、Fah欠損によって引き起こされる肝障害はNTBCによって防止でき、テッドベット 入金できないは生存することができます。ただ、NTBCをずっと投与しておく必要がありますが、それ離脱するとマウス肝テッドベット 入金できないが死に始めますが、この離脱時の投与の匙加減が難しいのが欠点です。このFahが関与するチロシンの代謝経路とNTBCの作用部位を図１に示します。
２．「Rag2-/-:Il2rg-/-」の特徴
結果の最初に以下のような興味ある記述が書かれていました。筆者らは当初、Fah-/-とヌード(Foxn1nu/nu)、NOD:SCID(PrkdcSCID/SCID )あるいはRag1 -/- との交配により、①Fah-/-: Foxn1nu/nu、②Fah-/-:NOD:SCID(PrkdcSCID/SCID )および③Fah-/-:Rag1-/-変異テッドベット 入金できないを作製しています。しかし、①Fah-/-:Foxn1nu/nuおよび③Fah-/-:Rag1-/-では、ヒト肝テッドベット 入金できないの生着は見られなかったようです。一方、②Fah-/-:Nod:PrkdcSCID/SCIDマウスでは、時折ヒトテッドベット 入金できないが生着したようです。しかし、これらのマウスのほとんどは急速に肝不全を発症し、NTBCの投与中止後に死亡しています。おそらくPrkdcSCID/SCIDテッドベット 入金できないに見られるDNA修復不全が原因であろうと書かれていますが、③の説明はありません。そこで筆者らは、Tテッドベット 入金できない、Bテッドベット 入金できない、ナチュラルキラーテッドベット 入金できないを完全に欠失し、DNA修復欠損のない免疫不全Fah -/-テッドベット 入金できないの作製を試みたようです。このため、ヒト造血異種移植片の優れたレシピエントであることが報告（Traggiai, E. et al. Science 304:104-107, 2004; Gorantla, S. et al. J. Virol. 81:2700-2712, 2007)されている「Rag2 -/- :IL2rg -/-」とFah-/-を交配し、「Fah-/-:Rag2-/-:Il2rg-/-」（FRGと略）三重変異体を作製しています。さて、今までのコラムで紹介してきた免疫寛容テッドベット 入金できないを思い出して欲しいのですが、それらの特徴を表１にまとめました。第5話で紹介した論文では、「Tg(Alb-uPA):Foxn1nu/nu」ですのでヌードマウスを用いていますが、ラット肝テッドベット 入金できないは生着しています。第6話では「Tg(Alb-uPA):Rag2-/-」で、Fah-/-:Rag1-/-とほぼ同じと思いますが、生着しています。第7話から第9話では「Tg(Alb-uPA):PrkdcSCID/SCID」でヒト肝テッドベット 入金できないは生着しています。しかし、前述したようにこの論文ではNODも入れ、より免疫寛容にしたFah-/-:Nod: PrkdcSCID/SCIDテッドベット 入金できないを用いた移植実験も行っていますが生着が悪いとのことです。要するに他の報告と比較するとこの論文での生着は概して悪いようです。理由は不明ですが、Fah欠損ではマウス肝テッドベット 入金できないの死滅する速度が速いことと、肝テッドベット 入金できないの増殖に適した環境が整えられていないせいかもしれません。一般的に免疫寛容状態が高いほど異種移植効率は高いと言われていますので、このことと関連するかもしれません。
３．テッドベット 入金できない
移植に用いられたヒト肝テッドベット 入金できないは9人の異なるドナーから得られたもので、このうち7つのサンプルは脳死臓器提供者の肝臓から、2つは外科的肝切除から単離されたものでした。年齢等も気になりますのでリストを表２に示しておきます。なお、ヒト肝テッドベット 入金できないの移植前にウロキナーゼ発現アデノウイルスをFRGテッドベット 入金できないに投与することが有益かどうかをまず調べています。3回の移植で、ヒト肝テッドベット 入金できないの一次生着を観察できたのは、最初にuPAアデノウイルスを投与されたレシピエントだけでした。そこで、その後の実験ではuPA前処置を行なっています。
手術が行われたピッツバーグ大学からヒト肝テッドベット 入金できないの輸送連絡があり次第、FRGテッドベット 入金できない(6-15週齢)にuPAウイルス（5x109プラーク形成単位（pfu）/マウス）を静脈注射（後眼窩）しています。輸送された肝テッドベット 入金できないは、到着後直ちに（分離後24-48時間）で移植されています。
FRGテッドベット 入金できないは、飲料水にNTBCを継続的に与えると、よく成長し、完全に受胎可能でした。従来のFah欠損単独テッドベット 入金できないと同様に、FRGテッドベット 入金できないでNTBCを中止すると、徐々に肝テッドベット 入金できない障害が起こり、4-8週間後に最終的に死亡しています。ヒト肝テッドベット 入金できないの移植は次の手順で行います。（１）FRGテッドベット 入金できないはNTBC16mg/Lの濃度の飲料水で飼育しておき、（２）uPAウイルスを腹腔内に投与し、（３）1〜2日後にヒト肝テッドベット 入金できないを移植し、（４）移植後、NTBC濃度を段階的に下げます。すなわち、1.6mg/Lを3日間、0.8mg/Lを2日間、0.4mg/Lで2日間、そしてNTBCを除去して14日間、その後NTBC16mg/Lで5日間、 1.6mg/Lを3日間、0.8mg/Lを2日間、0.4mg/Lで2日間、そしてNTBCを永続的に除去します。分かりにくいのでプロトコールを図２にまとめました。
４．ヒト肝テッドベット 入金できないの生着率と置換率
すべての実験において、使用したテッドベット 入金できないバッチにかかわらず、少なくとも1匹のFRGにヒト肝テッドベット 入金できないが明らかに生着したようです（表３）。移植片の生着は、組織学、DNA分析、酵素アッセイ、ヒト血清アルブミン(hAlb)濃度など、さまざまな方法で証明していますが、抗ヒトFAH抗体を用いた免疫染色（茶；黒矢印）では、80％以上の肝テッドベット 入金できないがFAH陽性でした（図３a）。赤矢印はFAH陰性テッドベット 入金できないを示しています。hAlb濃度によってモニターできた移植では、移植後4週目から10週目の間に初めて検出され、その後さらに数週間にわたって着実に増加し、43例の一次レシピエントのうち17例（39.5％；範囲12-67％）で生着が確認できました。このうち7匹は高度に再増殖し（30-90％）、hAlb濃度は1mg/mlを超えていました（本文中にはこの記述がありますが図3aを見ると17匹のデータはなく、5匹（緑、紫、黄色、青、赤）しか1mg/mlを超えていませんし(図３b）、この記述を裏付けるデータはどこにもありませんでした）。重要なことは、死体肝だけでなく肝切除肝からも、さらに、凍結保存した2つのヒト肝テッドベット 入金できないもFRGテッドベット 入金できないでも生着したことです（これはTg(uPA)ではすでに報告されています）。
５．肝臓ヒト化FRGテッドベット 入金できないの肝臓の構造と機能
肝臓ヒト化FRGテッドベット 入金できないの肝臓の組織構造を抗ヒトFAH抗体を用いた免疫染色とH&E染色で解析しています。FAH陽性ヒト肝テッドベット 入金できないは、マウス肝臓の構造に完全に組み込まれたように見えました（図4a-d）。いくつかの肝臓ヒト化FRGマウスでは、生着したヒト肝テッドベット 入金できないは、マウス肝臓の組織を乱すことなく、実質の80％以上を占めていました（図4b）。H&E染色により、クローン拡大したヒト肝テッドベット 入金できないは、形態学的に、つまりサイズによって、またその淡いテッドベット 入金できない質によってマウス肝テッドベット 入金できないと明確に区別することができました（図4c,d）。また、ヒト肝テッドベット 入金できないクラスターは好酸球が少ないため、周囲のマウステッドベット 入金できないよりも淡く見えます。したがって肝臓ヒト化FRGテッドベット 入金できないの肝臓の構造と機能は正常と思われます。他の肝臓ヒト化テッドベット 入金できないの論文でも、光学顕微鏡と免疫染色の結果から同じことが言われていますが、これだけで本当にいいのか、電子顕微鏡による解析でより微細な解析しなくていいのかが気になるところです。
６．腎臓の病変の有無
コラム第8話で紹介した論文(Tateno et al. Am. J. Pathol. 165:901-912, 2004)では、血清hAlb値が3mg/mlを超えるとヒト補体により腎障害が起こる、よってそれを防ぐためFuthanを投与することで高置換率の肝臓ヒト化テッドベット 入金できないを得ることができたと書かれていました。この論文では、これを検証するため、３匹の高度置換率テッドベット 入金できないをNTBC投与中止後4ヶ月間観察しています。しかし、体重と一般的な健康状態は正常であり、摘出時の腎臓は肉眼的にも組織学的にも正常であったと記載され、腎障害は観察されていません。また、第9話で紹介した論文は、第8話と同じグループからですが、ここでも高置換率の肝臓ヒト化テッドベット 入金できないが得られていますが、腎障害については述べられていません。理由は不明ですが、ひょっとすると腎障害は用いた系統のせいかもしれません。例えば、Tensin2変異テッドベット 入金できないではヒトに類似した慢性腎臓病が報告されています。このTensin2変異による腎臓病は興味深いことにテッドベット 入金できないの系統により病態が大きく異なります。例えばFVBテッドベット 入金できないにTensin2変異を導入すると腎症が引き起こされますが、C57BL/6テッドベット 入金できないにTensin2変異を導入しても腎症はほとんど見られません。つまりC57BL/6テッドベット 入金できないは腎症に対する抵抗性因子を持っていると考えられています。
７．連続移植
現在の肝臓異種移植モデルの限界の一つは、移植したヒト肝テッドベット 入金できないをさらに増殖させることができないことです。肝臓ヒト化FRGテッドベット 入金できない系における連続移植とは、最初に作製した肝臓ヒト化FRGテッドベット 入金できない回収し、次の新たなFRGマウスに移植する方法です。この可能性を検証するため、高度にヒト肝テッドベット 入金できないが再増殖した一次レシピエントの肝臓をコラゲナーゼで灌流し、FAH陽性ヒト肝テッドベット 入金できないとFAH陰性マウス肝テッドベット 入金できないを分離することなく、100万個の生存肝テッドベット 入金できないを二次FRGマウスに移植しました。一次移植に用いたテッドベット 入金できないとは対照的に、この方法で採取したヒト肝テッドベット 入金できないの生存率は80％以上であり、コラーゲンでコートした培養プレートに容易に接着しました（図５b-d）。ヒト肝テッドベット 入金できないの再生着では、ヒト肝テッドベット 入金できないは各世代で形態学的に類似しており、FAHに対する免疫染色によっても確認されました（図５f-h）。高度に再生着したテッドベット 入金できないの割合は、連続移植FRGで高く（17/28対7/43）（図3bと図5hを比較、ただし分母および分子の数は示されていません）、hAlbの増加率はより一定していました（図3bと図5hを比較）。このことは、連続継代により移植可能なヒト肝テッドベット 入金できないが濃縮されているのかもしれませんし、単にドナーマウスから新鮮に採取されたテッドベット 入金できないの品質と生存率が高いことを反映しているのかもしれません。
８．移植したヒト肝テッドベット 入金できないとマウス肝テッドベット 入金できないとの融合の検証
Okamuraらの論文(Okamura, K. et al. Histochem. Cell Biol. 125: 247-257, 2006)では、移植幹テッドベット 入金できないと宿主幹テッドベット 入金できないのテッドベット 入金できない融合が見かけ上の「肝テッドベット 入金できない再増殖」を説明できる可能性があることが示されました。具体的な内容は次のとおりです。まず霊長類であるカニクイザルのESテッドベット 入金できないの培養によりembryoid body (EB)を形成させ、肝臓で発現する遺伝子が確かに発現していることを確認しています。そのEBをAlb-uPA(+/-):PrkdcSCID/SCIDに移植して肝臓サル化テッドベット 入金できないを作製しています。その肝臓を解析しヒトDNA（サルDNAも検出できます）とテッドベット 入金できないpan-centromeric probes（テッドベット 入金できない特異的です）を用いてFISH(Fluorescence in-situ hybridization)解析を行いサルのEBテッドベット 入金できない（最後はDAB: 3,3'Diaminobenzidineで発色するので茶褐色に染まります）とマウス肝テッドベット 入金できない(FITC: Fluoresceinisothiocyanate isomer-Iでラベルされ緑に染まります)が融合している（同時に染色しておらずそれぞれの画像を重ねることで両方の色が見えるテッドベット 入金できないがあることで判定）ことを示しました（図６）。そこでこの肝臓ヒト化FRGテッドベット 入金できないでも融合が起こっているかどうかを検証するため、ヒトまたはテッドベット 入金できない特異的アルブミンとFAHに対する二重免疫染色を行っています。ほとんどの（95％以上）マウスアルブミン陽性肝テッドベット 入金できないは確かにFAH陰性であり（マウスの肝テッドベット 入金できないはFah遺伝子がノックアウトされていますのでFAHは陰性です）、ほとんどのFAH陽性肝テッドベット 入金できないはマウスアルブミン陰性でした（図7a-c）。一方、ヒトアルブミン陽性肝テッドベット 入金できないはほとんどすべて（90％以上）がFAH陽性でしたが、残りの肝テッドベット 入金できないは二重陰性でした（図7d-f）。テッドベット 入金できない融合がないことをさらに確認するため、フローサイトメトリーでヒトとマウスの抗主要組織適合複合体抗原を解析しています。高度に再増殖した肝臓では、両種の表面マーカーに陽性の肝テッドベット 入金できないは見つりませんでした（論文ではFig. 5g-jですが、ここでは省略します）。以上を総合すると、融合現象が起こったとしてもまれであり、連続移植を行った場合でも、増殖した肝テッドベット 入金できないの大部分は純粋にヒト由来であったことがわかります。
９．薬物代謝
生着したヒト肝テッドベット 入金できないの成熟状態を評価するために、肝臓ヒト化FRGテッドベット 入金できないにおけるヒト肝臓特異的遺伝子の基礎発現と誘導を調べています。薬物代謝に重要な遺伝子（CYP1A2、CYP3A4）の発現を定量的RT-PCR法を用いて、ヒト成体肝テッドベット 入金できない、ヒト胎児肝テッドベット 入金できない、肝臓ヒト化FRG肝臓からの肝テッドベット 入金できない（FRG肝テッドベット 入金できない）での遺伝子発現レベルを比較したところ、FRGでの発現レベルは、ヒト成体肝臓によく一致し、胎児肝臓とは異なっていました（図8）。
薬物検査におけるテッドベット 入金できないの有用性をさらに検証するため、単離肝テッドベット 入金できないの培養を確立し、チトクロームP450遺伝子のプロトタイプ誘導剤で処理しmRNA発現レベルを解析しました。まず誘導前の基礎遺伝子発現レベルですが、チトクローム（CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A7）、トランスポーター（ABCB11（旧名BSEP）、ABCC2（旧名MRP2））および薬物抱合酵素（UGT1A1）などの発現レベルは、FRG肝テッドベット 入金できないの活性は、培養した正常成人ヒト肝テッドベット 入金できないに見られるものと同等でした（図9）。さらにヒトCYP1Aおよび3Aファミリーの酵素活性を測定しました。エトキシレゾルフィン-O-デエチラーゼ活性（EROD）は、ヒト肝臓ではCYP1A1とCYP1A2によることが知られています。EROD活性は、FRG肝テッドベット 入金できないにおいて、BNF(β-ナフトフラボン)への事前の曝露によって特異的かつ強固に誘導されました（図10a）。また、フェノバルビタールまたはリファンピシンへによる事前の処理は、テストステロンの6-β-ヒドロキシルテストステロンへの変換を特異的に誘導しました（図10b）。このように、生着FRG肝テッドベット 入金できないは、これらの標準的な薬物代謝アッセイにおいて、正常なヒト成人肝テッドベット 入金できないと区別がつきませんでした。
１０．薬物代謝
これまでの研究に用いられたTg(Alb-uPA)テッドベット 入金できないには、冒頭に記載しましたが、実用上いくつかの大きな限界があります。それに対して肝臓ヒト化FRGテッドベット 入金できないは、いくつかの点でTg(Alb-uPA)モデルより優れています。第１に、NTBCを投与している限り容易に飼育交配ができます。第2に、肝疾患の程度は、NTBCの投与と中止によってコントロールでき、年齢に関係なくいつでもヒト肝テッドベット 入金できないを移植できます。第３に、Fah欠損変異は内在性Fah遺伝子の欠失であり、野生型に戻る可能性は稀です。したがって、Fahノックアウト肝臓では、内因性の復帰マウステッドベット 入金できないとの競合は存在しません。第4に、マウス肝テッドベット 入金できないの復帰がないということは、連続移植が可能であることを意味します。これはこの新しいシステムの大きな利点です。なぜなら連続移植によって、同じ遺伝子型のヒトテッドベット 入金できないを何世代ものレシピエントマウスに拡大することができるからです。ここでは、4回の移植が可能であることを証明しました。10％の生着効率（10万個のテッドベット 入金できない）と、置換後の最終的なヒト肝テッドベット 入金できない約1,500万個であると見積もると、各ラウンドで少なくとも150倍の肝テッドベット 入金できないを得ることができます。したがって、総増殖肝テッドベット 入金できない数は少なくとも1504＝5億倍になります。第５に、補体阻害剤を投与しなくても、肝臓ヒト化FRGテッドベット 入金できないでは高い置換率の肝臓ヒト化テッドベット 入金できないを得ることができます。ただ、これは「６．腎臓病変の有無」のところで記載しましたように、その後あまり問題になっておらず、FRGマウスの利点とはいえないかもしれません。第７に、品質が非常に多様で、あらゆる年齢のドナーのヒト肝テッドベット 入金できない調製物を用いて、生着と肝臓の再増殖を達成することができています。ここで用いたテッドベット 入金できないはすべて、移植の少なくとも24時間前に単離され、郵送されました。この遅れにもかかわらず、全てのバッチから一次生着が得られました。再増殖は若い死体ドナーに限らず、肝切除標本や凍結保存標本からも可能でした。最高齢のドナーは64歳でした。これらの所見は、FRG異種再増殖モデルの堅実性を示すものであり、新鮮な単離ヒト肝テッドベット 入金できないを入手できない学術的・商業的研究室を含む様々な環境において有用であることを示唆しています。もっとも、この利点も置換率80％以上を目指すことを現在の目標からすると利点とは言えないようです。ですが、総合的に見ると肝臓ヒト化FRGテッドベット 入金できないは優れているように思います。
次はまた別の新たなレシピエントテッドベット 入金できないの開発です
今回の論文では、FRGテッドベット 入金できないでは利点も多く、効率よく肝臓ヒト化テッドベット 入金できないを作製できることが示されました。次回は、別の新たなレシピエントテッドベット 入金できないで、テッドベット 入金できないの中では最も免疫寛容となっているNOG (NOD:PrkdcSCID/SCID;IL2rg-/-)テッドベット 入金できないの論文（Suemizu et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377:248-252, 2008）を紹介したいと思います。